本发明公开了一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,包括毛细管,所述毛细管为管径小于0.5cm、管长大于1cm的直管或弯管。进一步的,还包括检测管,毛细管的一端伸入检测管中。所述检测管上设有透气或不透气的密封盖,毛细管的一端穿过密封盖伸入检测管中。所述检测管的侧壁上设有平面贴壁,以方便与待检测样品的增菌容器内或外壁贴紧,防止脱落或丢失。所述检测管侧壁内或外设有磁铁。本发明的用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,可以用于毛细管培养法检测或筛选微生物,大部分菌属的检测或分离时间由现有技术中的36~48小时缩短为12~24小时,具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。
1.一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:包括毛细管,所述毛细管为管径小于0.5cm、管长大于1cm的直管或弯管。
2.根据权利要求1所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述毛细管的材质为玻璃、塑料、合成树脂或硅胶中的一种。
3.根据权利要求1所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述毛细管为管径为0.5~2mm、长度为2~20cm的直管或弯管。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:还包括检测管,毛细管的一端伸入检测管中。
5.根据权利要求4所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述检测管上设有密封盖,毛细管的一端穿过密封盖伸入检测管中。
6.根据权利要求4所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述检测管的侧壁上设有平面贴壁。
7.根据权利要求4所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述检测管侧壁内或外设有磁铁。
8.根据权利要求4所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述毛细管内填装有培养基。
9.根据权利要求1、2、3、5、6、7中任一项所述的一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,其特征在于:所述毛细管内填装有培养基。技术领域
本发明涉及一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置。
背景技术
目前,国内外微生物检验过程中分离培养主要是预增菌、增菌、选择性平板分离培养的方法,上世纪七十年代,以酶底物法显色为基本原理的显色培养基的发明大大提高了致病菌分离培养的特异性和敏感性。其基本原理为选择性增菌,划线分散成单个菌体,单菌体生长为单菌落并分解显色底物显色,需要两步,且需要大量的培养基及有经验的人工划线技术,耗时36-48小时。而众所周知,在化学物质和生物大分子分离过程中,以色谱层析或电泳为基本原理的分离方法快速省时且敏感性、特异性、准确性都比较高。但由于微生物不具溶解性,无法进行分配,因此不可能利用色谱层析。而且由于微生物个体太大无法进行有效常规电泳,有些科学家摸索了高效毛细管电泳的效果,结果表明在分离致病性球菌,如葡萄球菌和链球菌以及大肠杆菌方面有一定的有效性,但受生长环境、条件和生长时期等多种因素的影响,同种微生物会表现比较大的荷质比差异性,导致重现性很低,大大限制了它的适用性。那么是否可以想一种办法间接模拟色层原理呢?就如数字模拟信号解决数字信号的问题。从文献分析,导管装入半固体琼脂,一端接种沙门氏菌,可以在毛细管另一端解离出具有鞭毛的沙门氏菌;或在一端接种某菌种,导管中若添加某化学物质,可以检测其对该物质的趋药性。因此可否设计以微生物的运动性或趋药性为基本动力(模拟色谱层析中的动力),以选择性杂菌抑制剂为选择性基础物质(模拟色谱层析中的固相分配剂),以半固体琼脂为载体(模拟色谱层析中液相分配剂)的基本方法,即把毛细管一端放入样品增菌液,混合菌体经过装有特异性比较强的选择性杂菌抑制剂的半固体琼脂毛细管,随着混合菌体向前生长移动会受到反复的抑制性选择,最终杂菌会被全抑制,理论上讲最后目标菌会被彻底释放到毛细管另一端,如此就类似化学成分在色谱中不断进行再分配的结果,从而实现目标菌的快速高效分离。且从理论上分析,一大部分微生物具有鞭毛,具运动性;其它微生物可以利用其趋药性,因此动力上能够保证;而且从目前选择性培养基,如科玛嘉类显色培养基的显色选择性来分析,对大多数致病微生物可以筛选到特异性比较强的选择性杂菌抑制物质。因此用毛细管选择性半固体培养法理论上可以分离大部分微生物。迄今为止,尚未见到有用毛细管培养法检测或筛选微生物的报道。
发明内容
针对上述现有技术,本发明提供了一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,可用于检测或筛选微生物,大部分菌属的检测或分离时间由现有技术中的36~48小时缩短为12~24小时,具有快速、高效、省时省力、特异性好、敏感性强等优点。本发明是通过以下技术方案实现的:一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,包括毛细管,所述毛细管为管径小于0.5cm、管长大于1cm的直管或弯管。所述毛细管的材质为玻璃、塑料、合成树脂或硅胶中的一种,材质要求硬质不透水,透气或不透气根据目标微生物好氧情况选定,优选使用透明材质,透明材质易于观察培养基装填效果,也便于终点判定。最优选耐高压硬质无毒透明的材料。所述毛细管为管径为0.5~2mm、长度为2~20cm的直管或弯管。所述用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,还包括检测管,毛细管的一端伸入检测管中。所述检测管上设有透气或不透气的密封盖(塞),毛细管的一端穿过密封盖(塞)伸入检测管中。所述检测管的侧壁上设有平面贴壁,以方便与待检测样品的增菌容器内或外壁贴紧,防止脱落或丢失,检测时用胶带或磁条将此平面固定于增菌容器内或外壁上。所述检测管侧壁内或外设有磁铁,使用时,该磁铁可以通过与含铁的物品或其它磁铁的配合,而将检测管固定住,防止脱落或丢失。使用时,向毛细管中填装培养基(培养基为半固体培养基或液体培养基或固体培养基;培养基中含有供目标微生物生长的营养物质;培养基中含有或不含有选择性杂菌抑制剂或/和目标微生物显色剂),然后将填装后的毛细管的一端接入待检样本或待检样本的稀释液或增菌液中,或:将待检样本接入毛细管的一端(当有检测管时,同时向检测管中加入培养基,并将毛细管的另一端接入检测管的培养基中),培养0附图说明
图1为本发明的用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置的结构示意图(直管,无检测管);图2为本发明的用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置的结构示意图(弯管,有检测管)。其中,1、毛细管;2、检测管;3、密封盖;4、平面贴壁;5、磁铁。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明。一种用于毛细管培养法检测或筛选微生物的装置,包括毛细管1,如图1所示,毛细管为1管径1mm、管长10cm的直管。所述毛细管1的材质为玻璃。使用时,向毛细管1中填装培养基,然后将填装后的毛细管1的一端接入待检样本或待检样本的稀释液或增菌液中,或:将待检样本接入毛细管1的一端,培养01CFU/mL的沙门氏菌加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入到225mL缓冲蛋白胨水培养基(北京陆桥技术有限责任公司,以下各实施例中增菌液所用成品培养基均为该公司生产,有效期内使用)中。7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意18根,将一头插入样本增菌液中,持续至整个培养过程。将其中15根按3根为一组,每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基、毛细管半固体生化鉴定培养基、沙门氏菌生化鉴定培养基套装产品(S005,北京陆桥技术有限责任公司)、营养肉汤中,剩余3根不插入任何培养基。8、培养:步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱36°C,培养24h。观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基均呈现紫红色,初步判定样本中检出沙门氏菌。观察毛细管半固体生化鉴定培养基、沙门氏菌生化鉴定培养基套装产品的结果并记录,鉴定表明检出菌为沙门氏菌,结果见如表1所示:表1 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 将培养后营养肉汤液收集作为菌液使用或保存;培养后不插入任何培养基的3根毛细管选择性半固体另一端均可见明显菌生长混浊态,有沙门氏菌生长,点触或用取菌环接种到沙门氏菌显色平板和营养琼脂平板上培养24h,沙门氏菌显色平板上为紫红色菌落,证明为沙门氏菌,收集营养琼脂平板上菌落保存。实施例2xa0一种毛细管选择性半固体显色培养法检验单核细胞增生李斯特氏菌,步骤如下:1、毛细管的选取:选取内径0.5mm、1mm、2mm、长度2、5、10、20cm长玻璃毛细管若干根。2、选择性半固体培养基的制备:按配方胰胨5.0g、多价胨5.0g、酵母膏5.0g、氯化钠20.0g、磷酸二氢钾1.35g、磷酸氢二钠12.0g、琼脂粉4.0g和蒸馏水1000mL配比,加热溶解高压灭菌后取200mL,加入1%萘啶酮酸0.40mL,1%吖啶黄0.50mL,即得。3、液体和半固体显色培养基的制备:将CHROMAGAR李斯特氏菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司,批号975)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液,磁力搅拌溶解15min后,静置15min后取上清液100mL,为液体显色培养基(加热灭菌后分装每管1mL备用);取50mL液体显色培养基中加入0.4g2g琼脂加热溶解灭菌,即得半固体显色培养基。4、半固体生化鉴定培养基的制备:李斯特氏菌生化鉴定培养基套装产品(S014,北京陆桥技术有限责任公司)中三糖铁为半固体培养基,因此可直接不经处理备用。其余生化管为目标微生物生化反应底物、生化反应指示剂、营养物质混合液,每支管1mL中添加琼脂4.0mg,加热溶解灭菌,即得。5、毛细管的填装:将无菌毛细管插入上述步骤2~4制备的融化状态培养基,观察毛细管虹吸上缘,使毛细管整管填充后,室温静置至凝固,选择性半固体培养基装入0.5mm、1mm、2mm内径,5、10、20cm长毛细管若干根,半固体显色培养基和半固体生化鉴定培养基分别装入0.5mm、1mm、2mm内径,2cm长毛细管若干根。6、样本增菌夜的制备:将约10¹CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入到225mLxa0LB1培养基中。7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意18根,将一头插入样本增菌液中,持续至整个培养过程。将其中15根按3根为一组,每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基、毛细管半固体生化鉴定培养基、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定培养基套装产品(S0014,北京陆桥技术有限责任公司)、营养肉汤中,剩余3根不插入任何培养基。8、培养:步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱30°C,培养24h。观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基呈现蓝色,初步判定样本中检出单核细胞增生李斯特氏菌。观察毛细管半固体生化鉴定培养基、单核细胞增生李斯特氏菌生化鉴定培养基套装产品的结果并记录,鉴定表明检出菌为单核细胞增生李斯特氏菌,结果见如表2所示:表2 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 将培养后营养肉汤液收集作为菌液使用或保存;培养后不插入任何培养基的3根毛细管选择性半固体另一端可见明显菌生长混浊态,有单核细胞增生李斯特氏菌生长,点触或用取菌环接种到单核细胞增生李斯特氏菌显色平板和营养琼脂平板上培养24h,单核细胞增生李斯特氏菌显色平板上为蓝菌落,证明为单核细胞增生李斯特氏菌,收集营养琼脂平板上菌落保存。实施例3xa0一种毛细管选择性半固体显色培养法检验金黄色葡萄球菌步骤如下:1、毛细管的选取:选取内径0.5~5mm、长度2、5、10、20cm长玻璃毛细管若干根。2、选择性半固体培养基的制备:按配方胰胨17.0g、植物蛋白胨3.0g、氯化钠100.0g、磷酸氢二钾2.5g、丙酮酸钠10.0g、葡萄糖2.5g、琼脂粉4.0g和蒸馏水1000mL配比,加热溶解高压灭菌后备用。3、毛细管的填装:将步骤1所选毛细管插入步骤2制备的融化状态培养基,观察毛细管虹吸上缘,使毛细管整管填充后,室温静置至凝固。4、样本增菌夜的制备:将约10¹CFU/mL的金黄色葡萄球菌加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入225mLxa07.5%氯化钠肉汤中。5、显色培养基的制备:将CHROMAGAR金黄色葡萄球菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司,批号792)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液,磁力搅拌溶解15min后,静置15min后取上清液100mL加热灭菌后分装每管1mL备用。6、将制备好的毛细管半固体选择培养基一头插入样本增菌液,一头插入1mL显色培养基中。7、培养:将步骤6制备体系放入恒温恒湿培养箱36°C,24h培养。8、所有实验显色液变为红色,初步判定样本中检出金黄色葡萄球菌。实施例4xa0一种毛细管选择性半固体显色培养法检验副溶血性弧菌步骤如下:1、毛细管的选取:选取内径0.5~5mm、长度2、5、10、20cm长玻璃毛细管若干根。2、选择性半固体培养基的制备:按配方蛋白胨10.0g、氯化钠30.0g、琼脂粉4.0g和蒸馏水1000mL配比,加热溶解高压灭菌后备用。3、液体显色培养基的制备:将CHROMAGAR副溶血性弧菌显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司,批号938)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液,磁力搅拌溶解15min后,静置15min后取上清液100mL加热灭菌后分装每管1mL备用。4、半固体显色培养基的制备:将步骤5所制液体显色培养基加入0.4g琼脂加热溶解灭菌,即得。5、毛细管的填装:将步骤1所选毛细管插入步骤2和5制备的融化状态培养基,观察毛细管虹吸上缘,使毛细管整管填充后,室温静置至凝固,选择性半固体培养基装入各0.5mm、1mm、2mm内径,5、10、20cm长毛细管若干根,半固体显色培养基装入0.5mm、1mm、2mm内径,2cm长毛细管若干根。6、样本增菌夜的制备:将约10¹CFU/mL的副溶血性弧菌加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入225mLxa03%氯化钠碱性胨水。7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意9根,将一头插入样本增菌液中,持续至整个培养过程。将其中6根按3根为一组,每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基中,剩余3根不插入任何培养基。8、步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱36°C,培养24h。观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基均呈现紫红色,初步判定样本中检出副溶血性弧菌。培养后不插入任何培养基的3根毛细管选择性半固体另一端可见明显菌生长混浊态,有副溶血性弧菌生长,点触或用取菌环接种到副溶血性弧菌显色平板和营养琼脂平板上培养24h,副溶血性弧菌显色平板上为紫红色菌落,证明为副溶血性弧菌,收集营养琼脂平板上菌落保存。实施例5xa0一种毛细管选择性半固体显色培养法检验阪崎肠杆菌步骤如下:1、毛细管的选取:选取内径0.5~5mm、长度2、5、10、20cm长玻璃毛细管若干根。2、选择性半固体培养基的制备:按配方胰蛋白胨20.0g、氯化钠34.0g、乳糖5.0g、磷酸二氢钾2.75g、磷酸氢二钾2.75g、十二烷基磺酸钠0.1g、琼脂粉4.0g和蒸馏水1000mL配比,加热溶解高压灭菌后,加入10.0mg万古霉素备用。3、液体显色培养基的制备:将DFI阪崎肠杆菌显色培养基(CM1055,英国OXOID公司,批号929066)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液,磁力搅拌溶解15min后,静置15min后取上清液100mL加热灭菌后分装每管1mL备用。4、半固体显色培养基的制备:将步骤5所制液体显色培养基加入0.4g琼脂加热溶解灭菌,即得。5、毛细管的填装:将步骤1所选毛细管插入步骤2和5制备的融化状态培养基,观察毛细管虹吸上缘,使毛细管整管填充后,室温静置至凝固,选择性半固体培养基装入各0.5mm、1mm、2mm内径,5、10、20cm长毛细管若干根,半固体显色培养基装入0.5mm、1mm、2mm内径,2cm长毛细管若干根。6、样本增菌夜的制备:将约10¹CFU/mL的阪崎肠杆菌加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入225mLxa0mLST肉汤培养基。7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意9根,将一头插入样本增菌液中,持续至整个培养过程。将其中6根按3根为一组,每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基中,剩余3根不插入任何培养基。8、步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱36°C,培养24h。观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基均呈现蓝绿色,初步判定样本中检出阪崎肠杆菌。培养后不插入任何培养基的3根毛细管选择性半固体另一端可见明显菌生长混浊态,有阪崎肠杆菌生长,点触或用取菌环接种到阪崎肠杆菌显色平板和营养琼脂平板上培养24h,阪崎肠杆菌显色平板上为蓝绿色菌落,证明为阪崎肠杆菌,收集营养琼脂平板上菌落保存。实施例6xa0一种毛细管选择性半固体显色培养法检验大肠埃希氏菌O157:H7/NM步骤如下:1、毛细管的选取:选取内径0.5~5mm、长度2、5、10、20cm长玻璃毛细管若干根。2、选择性半固体培养基的制备:按配方胰蛋白胨20.0g、氯化钠5.0g、乳糖5.0g、磷酸二氢钾1.5g、七水磷酸氢二钾4.0g、3号胆盐1.12g、琼脂粉4.0g和蒸馏水1000mL配比,加热溶解高压灭菌后,加入20.0mg新生霉素备用。3xa0液体显色培养基的制备:将CHROMAGAR大肠埃希氏菌O157:H7/NM显色培养基(郑州博赛生物技术股份有限公司,批号426)按照说明书比例加入去离子水配制成200mL悬液,磁力搅拌溶解15min后,静置15min后取上清液100mL加热灭菌后分装每管1mL备用。4、半固体显色培养基的制备:将步骤5所制液体显色培养基加入0.4g琼脂加热溶解灭菌,即得。5、毛细管的填装:将步骤1所选毛细管插入步骤2和5制备的融化状态培养基,观察毛细管虹吸上缘,使毛细管整管填充后,室温静置至凝固,选择性半固体培养基装入各0.5mm、1mm、2mm内径,5、10、20cm长毛细管若干根,半固体显色培养基装入0.5mm、1mm、2mm内径,2cm长毛细管若干根。6、样本增菌夜的制备:将约10¹CFU/mL的大肠埃希氏菌O157:H7/NM加入到100mL鲜牛奶中作为样本,取检样25g加入225mLxa0mEC-n肉汤培养基中。7、选取步骤5制备好的毛细管选择性半固体培养基任意9根,将一头插入样本增菌液中,持续至整个培养过程。将其中6根按3根为一组,每组中另一头分别插入上述制备的毛细管半固体显色培养基、液体显色培养基中,剩余3根不插入任何培养基。8、步骤7制备的毛细管选择性半固体体系放入恒温恒湿培养箱36°C,培养24h。观察其中3根毛细管半固体显色培养基一端和3根液体显色培养基均呈现红色,初步判定样本中检出大肠埃希氏菌O157:H7/NM。培养后不插入任何培养基的3根毛细管选择性半固体另一端可见明显菌生长混浊态,有大肠埃希氏菌O157:H7/NM生长,点触或用取菌环接种到大肠埃希氏菌O157:H7/NM显色平板和营养琼脂平板上培养24h,大肠埃希氏菌O157:H7/NM显色平板上为红色菌落,证明为阪崎肠杆菌,收集营养琼脂平板上菌落保存。实施例7xa0沙门氏菌使用毛细管选择性半固体培养法与GB4789.4-2010微生物检验方法进行定性检测的比较使用加标回收法模拟样品进行实验,接种量为约10¹、10²、10³cfu沙门氏菌,严格按照上述方法及GB4789.4-2010微生物检验方法进行实验,结果如表3:表3 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例8xa0单核细胞增生李斯特氏菌使用毛细管选择性半固体培养法与GB4789.30-2010微生物检验方法进行定性检测的比较使用加标回收法模拟样品进行实验,接种量为约10¹、10²、10³cfu单核细胞增生李斯特氏菌,严格按照上述方法及GB4789.30-2010微生物检验方法进行实验,结果如表4:表4 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>